Q＆A

Q-1 血清為什么比原來貴？

A-1  a. 市場需求持續增加（生物產業發展迅猛）

細胞治療、單抗生產、抗體藥生產、疫苗生產等

b. 血源有限

2013年下半年，南美血清開始緊張，

2014年8月底，澳洲血清禁止出口；即便不禁止，血清供應也是緊張的，牛對環境污染是很嚴重的，在澳洲牛的數量是受到嚴格限制的；

C. 國內：牛肉及其牛相關食品的市場要進大于血清市場。隨著國外疫情蔓延，可進口的牛肉越來越少，所以對國內牛肉的需求比以前大大增加，價格也上漲很多，即成牛的需求增加。血清采集的成本隨之增加。

Q-2 如何儲存和解凍血清才不會使產品質量受損?

A-2 建議血清應保存在-2O℃。若一次無法用完一瓶，無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內，再放回冷凍。

將血清從冷凍箱取出后，置于2～8℃冰箱緩慢融解，一般是融解過夜。

Q-3 血清中包含絮狀沉淀，它們是什么，怎么處理?

A-3  沉淀主要成分是纖維蛋白和脂蛋白，不會影響血清品質，但必須去除，因為沉淀會影響細胞與細胞之間的聯系，誘導細胞聚集，影響細胞貼壁等。

首先讓其沉淀在瓶子底部，中上層無沉淀血清直接使用；下層血清裝到50ml無菌離心管，400g，離心3分鐘即可除去(一般不建議采用過濾的方法除去沉淀，因為沉淀會堵塞濾膜而無法過濾)。

Q-4 實驗室如何選擇適合的血清?

A-4  稀有的澳洲血清培養嬌貴細胞（小鼠ES、原代細胞分離培養）；南美血清或國產胎牛血清用于癌細胞、常見細胞系培養；新生牛血清用于病毒包裝（構建穩轉細胞株）。

Q-5 培養基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎?

A-5您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素，應該在2周內使用。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

Q-6 有必要做熱滅活嗎?

A-6 實驗證實，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。而且經過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環境中，又會使此沉淀物增更多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。

若非必須，無需熱處理這一步。不但節省時間，更確保血清的質量!

Q-7 細胞培養中出現黑點是污染嗎?如何處理?

A-7 您在細胞培養的過程中發現有黑點生成，首先，要肉眼觀察培養基是否混濁，然后，在鏡下觀察培養細胞生長的狀態，黑點是否游動。如果細胞被污染，微生物則會大量繁殖，培養基就會迅速變黃、變混濁。污染包括細菌污染、支原體污染等。

如果在鏡下觀察細胞，生長狀態良好，不黑點出現前相比，沒有任何變化，那么，黑點的出現可能不以下幾種情況有關：

a、細胞生長過老，破碎的細胞殘骸;

b、血清質量不好，反復凍融的結果;

c、配制培養基的pH值偏高，不宜細胞生長;

d、培養原代細胞中出現小黑點，可能是原代組織中的雜質，多次傳代可以消除。

Q-8 培養細胞不貼壁？怎么辦？

A-8

可能原因	解決辦法
胰蛋白酶消化過度	縮短消化時間或降低胰蛋白酶濃度
支原體污染	如發現支原體污染，及時丟棄培養物。
細胞老化（如傳代前細胞已匯合導致失去貼附性）	復蘇新的保種細胞
消化液戒培養液配制錯誤、過期儲存、儲存不當	重新配置消化液或培養液
接種細胞起始濃度太低或太高	調節最佳接種細胞濃度

名稱	貨號	適應類型
胎牛血清（澳洲）	XQ-2001	部分干細胞、原代細胞等嬌貴細胞及腫瘤細胞、常見細胞系
胎牛血清（南美）	XQ-2010	部分原代細胞及腫瘤細胞、常見細胞系
胎牛血清（標準級）	XQ-1010	腫瘤細胞、部分細胞系、293細胞
新生牛血清	XQ-1002 XQ-1001	部分腫瘤細胞、293細胞

     我國的試劑規格基本上按純度（雜質含量的多少）劃分，共有高純、光譜純、基準、分光純、優級純、分析和化學純等7種。

 

     國家和主管部門頒布質量指標的主要優級純、分級純和化學純3種。
（1）優級純（GR：Guaranteed reagent），又稱一級品或保證試劑，99.8%，這種試劑純度最高，雜質含量最低，適合于重要精密的分析工作和科學研究工作，使用綠色瓶簽。
（2）分析純（AR），又稱二級試劑，純度很高，99.7%，略次于優級純，適合于重要分析及一般研究工作，使用紅色瓶簽。
（3）化學純（CP），又稱三級試劑，≥ 99.5%，純度與分析純相差較大，適用于工礦、學校一般分析工作。使用藍色（深藍色）標簽。
（4）實驗試劑（LR：Laboratory reagent），又稱四級試劑。

     除了上述四個級別外，目前市場上尚有：
基準試劑（PT：Primary Reagent）：專門作為基準物用，可直接配制標準溶液。

光譜純試劑（SP：Spectrum pure）：表示光譜純凈。但由于有機物在光譜上顯示不出，所以有時主成分不到99.9%以上，使用時必須注意，特別是作基準物時，必須進行標定。

     高純試劑:純度遠高于優級純的試劑 高純試劑通常應用于（≥ 99.99%），例如針對色譜使用的色譜純試劑、針對光譜使用的光譜純試劑。不同行業使用的高純試劑有各自的標注方式 ，純度表示:通用的標注是用9的數目來表示。例如，純度為99.999%，含五個九則表示為5N；純度為99.995%，含四個九一個五，表示為4.5N。

     目前，國外試劑廠生產的化學試劑的規格趨向于按用途劃分，常見的如下：
生化試劑 （BC：Biochemical）
生物試劑 （BR：Biological reagent）
生物染色劑 （BS：Biological Stain）
絡合滴定用 （FCM：For Complexometry）

色譜分析（FCP：For chromatography purpose）
熒光分析（FIA）
微生物用（FMB）
顯微鏡用 （FMP：For microscopic purpose）
合成用（FS：For synthesis）
氣相色譜（GC：Gas chromatography）
高壓液相色譜 （HPLC：High Pressure Liquid chromatography）
指示劑（Ind：Indicator）
紅外吸收（IR）
液相色譜（LC）
核磁共振（NMR）
有機分析標準（OSA：Organic analytical standard）
分析用（PA：Pro analysis）
實習用 （Pract： Practical use）
Puriss （Purissmum 特純）
合成（SYN）
工業用(Tech:Techincal grade）
薄層色譜（TLC：Thin Layer chromatography）
分光純、光學純、紫析分光光度純（UV：Ultra violet pure）

       高通量測序（High-Throughput Sequencing）又名下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS），是相對于傳統的桑格測序（Sanger Sequencing）而言的。目前高通量測序的主要平臺代表有羅氏公司(Roche)的454測序儀（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD測序儀（ABI SOLiD sequencer）。

454公司首選將焦磷酸測序應用在測序技術上，之后便被羅氏診斷收購，形成了目前的Roche 454。待測DNA樣品被打斷成300-800bp的片段后，3' 和5'端分別加上接頭，這些接頭會使DNA片段結合到微珠上。測序PCR反應就發生在固相的微珠上，并且整個PCR反應和相關的酶被油包水的液滴包裹，每個油滴系統只包含1個DNA模板。擴增后，每個DNA分子可以得到富集，每個微珠只能形成一個克隆集落。454測序儀的測序通道體積非常狹小，只能容納一個微珠。測序過程中，GS FLX系統會將引物上dNTP的聚合與熒光信號釋放偶聯起來。通過檢測熒光信號，就可以達到DNA測序的目的。相對于Sanger測序，Solexa和Solid測序而言，454可以提供中等的讀長和適中的價格，適合de novo 測序、轉錄組測序、宏基因組研究等。

Solexa的測序原理是可逆終止化學反應。DNA片段加上接頭之后，可以隨機的附著于玻璃表面（Flow cell），并且在固相的表面經過橋式擴增。這樣就形成了數千份相同的單分子簇，被用做測序模板。測序采取邊合成邊測序的方法，和模板配對的ddNTP原料被添加上去，不配對的ddNTP原料被洗去，成像系統能夠捕捉熒光標記的核苷酸。隨著DNA 3'端的阻斷劑的去除，下一輪的延伸就可以進行。和焦磷酸測序不同，每次DNA的只能延伸一個核苷酸。Solexa的讀長在100-150bp之間，適合小RNA鑒定、甲基化和表觀遺傳學研究。

ABI Solid技術的核心是4種熒光標記寡核苷酸的連接反應測序。測序之前，DNA模板通過乳化PCR擴增，和Roche 454的基本相同，只是Solid的微珠更小，只有1μm。3'端修飾的微珠可以沉淀在玻片上。連接測序所用的底物是8個堿基熒光探針混合物，根據序列的位置，樣品DNA就可以被探針標記。DNA連接酶優先連接和模板配對的探針，并引發該位點的熒光信號的產生。Solid的讀長只有50-75bp，精確度可達Q40，適于基因組重測序和SNP檢測。

三個廠家的高通量測序儀器雖然各具特點，在原理上很多的共同之處：

1 將目標DNA剪切為小片段

2 單個小片段DNA分子結合到固相表面

3 單分子獨立擴增

4 每次只復制一個堿基（A,C,T,G）并檢測信號

5 高分辨率的成像系統

高通量測序以其高輸出量與高解析度的特性，不僅為我們提供了豐富的遺傳學信息，而且使得測序的費用和時間大大縮短。在高通量測序發展的過程中，也有很多的問題需要我們去解決：數據在臨床診斷上的作用，測序數據的儲存和分析，數據的安全和信息隱私等。

摩爾

     科學上把含有阿伏伽德羅常數（約6.02×10^23)個微粒的集體作為一個單位，叫摩爾 。摩爾是表示物質的量（符號是n）的單位，簡稱為摩，單位符號是mol。 物質的量是物理量，表示含有一定數目粒子的集合體，符號為n。物質的量的單位為摩爾。1mol不同物質中所含的粒子數是相同的，但由于不同粒子的質量不同，1mol不同物質的質量也不同。

摩爾濃度計算

溶液中溶質的質量、溶液濃度和體積之間的關系，公式為:

質量 (g) = 濃度 (mol/L) x 體積 (L) x 分子量 (g/mol)

稀釋計算

配置特定濃度的溶液，使用的計算公式為：

開始濃度 x 開始體積 = 最終濃度 x 最終體積

稀釋公式

稀釋公式一般簡略地表示為: C1V1 = C2V2 

MSDS / COA批次特異的分子量。

蒸餾水：就是將水蒸餾、冷凝的水，蒸二次的叫重蒸水，三次的叫三蒸水。水中可能含有與沸點相接近的物質，蒸餾法很難清除。

去離子水：經過陰、陽離子交換柱以后的水，雜質陰、陽離子均已除去，故稱為去離子水.去離子水除掉的是離子化合物，沒有離子化的有機物或微生物則不能被清除。

高純水：是高純度水的統稱了，不管你是蒸餾水，或離子交換，或EDI（Electrodeionization）連續電除鹽技術，或電滲透，或反滲透，或膜分離或其組合工藝等各種工藝制得高純度水，都可稱為高純水。
也有的說高純水專門是指經過混床處理的除鹽水，其純度要高于蒸餾水，高純水電導率<0.2，而蒸餾水電導率<2.0(μc/cm2)。

超純水：水的電導率達到18MΩ/cm3的水，則稱為超純水。通過數次高性能的離子交換樹脂處理后再經過微孔濾膜過濾，所得到水的電導率可達18MΩ/cm3，接近理論純水的18.3MΩ/cm3，即為超純水。可以通過超純水器制備。超純水既無離子也無微生物，可用于分子克隆，dna測序，細胞培養等各種精細試驗。

試驗用水可分為去離子水，蒸餾水（雙蒸水）、超純水三個級別，一般的試驗器皿器具的洗凈用去離子水即可，一般試劑配置可用雙蒸餾水，而重要的精細試驗應用超純水。

編號	P00001	P00036	P00002	P00035	P00003	P00004	P00037	P00039
名稱	Western及IP細胞裂解液	RIPA裂解液(高)	RIPA裂解液(中)	RIPA裂解液(低)	NP-40裂解液	SDS裂解液	Western及IP細胞裂解液(無抑制劑)	RIPA裂解液(強，無抑制劑)
組分	1% Triton X-100	1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS	1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS	1% NP-40, 0.25% deoxycholate	1% NP-40	1% SDS	1% Triton X-100	1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS
裂解強度	溫和	強	中	溫和	溫和	強	溫和	強
膜蛋白	一般	很好	較好	一般	一般	很好	一般	很好
胞漿蛋白	很好	很好	很好	很好	很好	很好	很好	很好
核蛋白	較好	很好	較好	較好	較好	很好	較好	很好
胞漿磷酸化蛋白	很好	很好	很好	很好	很好	很好	很好	很好
細胞核轉錄因子	很好	很好	很好	很好	很好	很好	很好	很好
含蛋白酶抑制劑	是	是	是	是	是	是	否	否
含磷酸酯酶抑制劑	是	是	是	是	是	是	否	否
主要用途	WB, IP,co-IP	WB, IP	WB, IP	WB, IP, co-IP	WB, IP,co-IP	WB, ChIP	WB, IP,co-IP	WB, IP